Микробиология, санитария и гигиена в пищевом производстве
Микробиология, санитария и гигиена в пищевом производстве
Б79 Микробиология, санитария и гигиена в пищевом производстве.
Практические работы. Методическое пособие для студентов / Е.А. Болдесова. – Северск: Северский промышленный колледж, 2018. - 47 с.
В методическом пособии представлены указания по выполнению практических работ, направленные на углубление теоретических положений лекционного курса общепрофессиональной дисциплины «Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевом производстве» и освоение методики микробиологического эксперимента.
Методическое пособие по выполнению практических работ предназначено для студентов, обучающихся по специальности 43.02.15 «Поварское и кондитерское дело», изучающих курс дисциплины «Микробиология, санитария и гигиена в пищевом производстве».
Вы уже знаете о суперспособностях современного учителя?
Тратить минимум сил на подготовку и проведение уроков.
Быстро и объективно проверять знания учащихся.
Сделать изучение нового материала максимально понятным.
Избавить себя от подбора заданий и их проверки после уроков.
МИКРОБИОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ И ГИГИЕНА В ПИЩЕВОМ ПРОИЗВОДСТВЕ
Методическое пособие по выполнению практических работ
Северск
2018
ББК 51.23
Б79
Согласовано
на заседании Методического совета ОГБПОУ «СПК»
10.10.2018
Одобрено
на заседании кафедры общественного питания «СПК»,
протокол № 2 от 27.09.2018.
Рецензент:
Заместитель директора по научно-исследовательской, учебно-методической работе
ОГБПОУ «СПК»,
к. э. н., Летаева Т.В.
Болдесова Е.А.
Б79 Микробиология, санитария и гигиена в пищевом производстве.
Практические работы. Методическое пособие для студентов / Е.А. Болдесова. – Северск: Северский промышленный колледж, 2018. 47 с.
В методическом пособии представлены указания по выполнению практических работ, направленные на углубление теоретических положений лекционного курса общепрофессиональной дисциплины «Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевом производстве» и освоение методики микробиологического эксперимента.
Методическое пособие по выполнению практических работ предназначено для студентов, обучающихся по специальности 43.02.15 «Поварское и кондитерское дело», изучающих курс дисциплины «Микробиология, санитария и гигиена в пищевом производстве».
1 Техника безопасности при работе в микробиологической лаборатории ………………………………………….…………………..
5
2 Требования к оформлению практической работы.…………………..
6
3 Требования к выполнению практической работы…………………...
7
3.1 Практическая работа № 1….…………..…….…...…….………..
9
3.2 Практическая работа № 2…………………..……………………
12
3.3 Практическая работа № 3………………………………………..
19
3.4 Практическая работа № 4………………………………………..
25
3.5 Практическая работа № 5………………………………………..
33
3.6 Практическая работа № 6………………………………………..
38
3.7 Практическая работа № 7………………………………………..
41
Список литературы………………………………………………………
46
ВВЕДЕНИЕ
В методическом пособии представлены практические работы по микробиологии для студентов колледжей по специальности 43.02.15 «Поварское и кондитерское дело», изучающих курс «Микробиология, санитария и гигиена в пищевом производстве».
Цель практических работ – углубление теоретических положений лекционного курса микробиологии и освоение методики микробиологического эксперимента. Пособие включает практические работы по разделам курса:
- «Морфология и структурно-функциональная организация прокариот»;
- «Физиология и метаболизм прокариот»;
- «Рост и культивирование прокариот»;
- «Систематика и классификация прокариот»;
- «Санитария и гигиена в пищевом производстве».
В конце каждой работы приводятся вопросы для закрепления теоретического и экспериментального материала. Приведенные работы рассчитаны на два часа.
В каждой из предлагаемых работ приведены список материалов и оборудования, краткие теоретические объяснения, описание хода работы, рекомендации по оформлению результатов. Практические работы содержат справочный материал, позволяющий студенту лучше уяснить содержание практической работы.
Работы выполняются по два человека. Выполнению работы предшествует ознакомление с теоретическими положениями и ходом работы, формулирование цели и задач исследования. Пользуясь пособием, студенты оформляют результаты эксперимента в соответствии с учебной картой занятия. Работы предусматривают самостоятельную формулировку выводов с обоснованием полученных результатов. Анализ записей и усвоение изучаемого материала контролируется преподавателем на каждом занятии.
1 ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ ПРИ РАБОТЕ
В МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ
1. К работе в учебной микробиологической лаборатории допускаются лица после прохождения инструктажа по технике безопасности.
2. Запрещается входить в микробиологическую лабораторию в верхней одежде.
3. К занятию допускаются студенты только при наличии медицинского халата.
4. В микробиологическую лабораторию запрещено вносить пищу, питьевую воду, посторонние вещи. В лаборатории запрещается курить и принимать пищу.
5. За каждым студентом закрепляется постоянное рабочее место (номер рабочего места записывается студентом на титульном листе лабораторной тетради).
6. На рабочем месте размещаются только необходимые для выполнения конкретной лабораторной работы оборудование и материалы.
7. Приступать к работе и перемещаться по лаборатории во время занятия только с разрешения преподавателя.
8. При работе с микроорганизмами соблюдать осторожность и придерживаться приемов, исключающих возможность инфицирования.
9. Запрещается прикасаться к микробным культурам руками.
10. Если микроорганизмы случайно попали на стол, следует немедленно удалить их тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором. При работе с жидкой культурой пользоваться спецсредствами для забора микроорганизмов.
10. Не зажигать одну спиртовку от другой. Закрывать фитиль спиртовки колпачком между использованиями.
11. Соблюдать меры безопасности при обращении с электроприборами. Перед работой проверить исправность электрооборудования. Без разрешения преподавателя не включать электроприборы в сеть.
12. В конце работы привести в порядок рабочее место. Тщательно вымыть руки и обработать ватным тампоном с дезинфицирующим раствором. Халат сложить в полиэтиленовый пакет.
13. Выполнение правил техники безопасности контролируют дежурные студенты, которые также проверяют в конце занятия порядок рабочих мест.
2 ТРЕБОВАНИЯ К ОФОРМЛЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ
Практические работы оформляются в тетради каждым студентом индивидуально. Тетрадь для практических работ подписывается студентом до начала выполнения первой практической работы.
Каждая практическая работа должна содержать следующие структурные элементы:
- тема;
- цель;
- перечень необходимых материалов и оборудования;
- результаты и обсуждение;
- контрольные вопросы;
- вывод.
Практическая работа, оформленная в соответствии с данными требованиями, предоставляется в конце каждого занятия на оценивание преподавателю.
3 ТРЕБОВАНИЯ К ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ
Практические занятия должны быть тесно связаны с теоретическим курсом микробиологии. На практических занятиях студенты закрепляют полученные теоретические знания, осваивают методы микробиологического исследования и правила работы с культурами микроорганизмов. Весьма важно, чтобы студенты научились соблюдать правила личной гигиены и профилактики, бережно относиться к лабораторному оборудованию и аппаратуре, особенно к микроскопу.
Микробиологическая лаборатория должна содержаться в идеальной чистоте. В ней не должно находиться никаких лишних предметов. Уборку лаборатории необходимо проводить регулярно и только влажным способом. Пол, стены, мебель следует обрабатывать растворами дезинфицирующих средств.
На первом практическом занятии студенты должны ознакомиться с правилами техники безопасности и режимом работы лаборатории.
Входя в лабораторию, надеть халат, проверить, все ли предметы находятся на рабочем месте и исправлен микроскоп. Обо всех неисправностях и недостатках сообщать преподавателю. Во время выполнения практических работ соблюдать тишину, избегать излишнего хождения, открывания и закрывания дверей, что усиливает движение воздуха. В лаборатории не принимать пищу, не выносить за пределы лаборатории какие бы то ни было материалы (пробирки, краски и т.п.), личные вещи (книги, сумки) держать в отведенном для этого месте. При себе иметь цветные карандаши и тетрадь для записей занятий по микробиологии. Зарисовку микропрепарата производить непосредственно с препарата, а не из книги или таблицы.
По окончании занятий привести в порядок рабочий стол, протереть и убрать микроскоп, тщательно вымыть руки и снять халат.
Инструменты после использования должны обезвреживаться прокаливанием в пламени, кипячением, дезинфекцией и другими способами. Все использованные материалы с микроорганизмами, использованные микробные культуры необходимо сначала обеззараживать дезинфекцией и только после этого мыть лабораторное оборудование.
Материал по каждому занятию излагается в следующей последовательности: вначале кратко формируется цель занятия, затем определяется конкретное задание и порядок выполнения, приводится перечень необходимого оборудования, а также методические указания по проведению занятий и контрольные вопросы.
Критерии оценивания практических работ
Отметка "5" ставится, если обучающийся:
1. Правильно определил цель опыта.
2. Выполнил работу в полном объеме с соблюдением необходимой последовательности проведения опытов и измерений.
3. Самостоятельно и рационально выбрал и подготовил для опыта необходимое оборудование, все опыты провел в условиях и режимах, обеспечивающих получение результатов и выводов с наибольшей точностью.
4. Научно грамотно, логично описал наблюдения и сформулировал выводы из опыта. В представленном отчете правильно и аккуратно выполнил все записи, таблицы, рисунки, графики, вычисления и сделал выводы.
5. Проявляет организационно-трудовые умения (поддерживает чистоту рабочего места и порядок на столе, экономно использует расходные материалы).
6. Эксперимент осуществляет по плану с учетом техники безопасности и правил работы с материалами и оборудованием.
Отметка "4" ставится, если обучающийся:
1. Опыт проводил в условиях, не обеспечивающих достаточной точности измерений.
2. Или было допущено два-три недочета.
3. Или не более одной негрубой ошибки и одного недочета. 4. Или эксперимент проведен не полностью.
5. Или в описании наблюдений из опыта допустил неточности, выводы сделал неполные.
Отметка "3" ставится, если обучающийся:
1. Правильно определил цель опыта; работу выполняет правильно не менее чем наполовину, однако объём выполненной части таков, что позволяет получить правильные результаты и выводы по основным, принципиально важным задачам работы.
2. Или подбор оборудования, объектов, материалов, а также работы по началу опыта провел с помощью учителя; или в ходе проведения опыта и измерений были допущены ошибки в описании наблюдений, формулировании выводов.
3. Опыт проводился в нерациональных условиях, что привело к получению результатов с большей погрешностью; или в отчёте были допущены в общей сложности не более двух ошибок (в записях единиц, измерениях, в вычислениях, графиках, таблицах, схемах, и т.д.) не принципиального для данной работы характера, но повлиявших на результат выполнения.
4. Допускает грубую ошибку в ходе эксперимента (в объяснении, в оформлении работы, в соблюдении правил техники безопасности при работе с материалами и оборудованием), которая исправляется по требованию учителя.
Отметка "2" ставится, если обучающийся:
1. Не определил самостоятельно цель опыта; выполнил работу не полностью, не подготовил нужное оборудование и объем выполненной части работы не позволяет сделать правильных выводов.
2. Или опыты, измерения, вычисления, наблюдения производились неправильно. 3. Или в ходе работы и в отчете обнаружились в совокупности все недостатки, отмеченные в требованиях к оценке "3".
4. Допускает две (и более) грубые ошибки в ходе эксперимента, в объяснении, в оформлении работы, в соблюдении правил техники безопасности при работе с веществами и оборудованием, которые не может исправить даже по требованию учителя.
Практическая работа №1
Тема «Изучение, ознакомление с оборудованием и принадлежностями микробиологической лаборатории»
Цель
Ознакомление студентов с назначением, устройством, оборудованием и режимом работы микробиологической лаборатории.
Оборудование
Приборы оптические (микроскопы, лупы), приборы термические (термостаты, автоклавы, аппараты Коха, сушильные шкафы, холодильники, микробиологические (бактериологические иглы, петли, шпатели) и хирургические инструменты (скальпели, пинцеты, держатели, ножницы), а также пробирки, чашки Петри, покровные и предметные стекла, стеклянные трубочки, капельницы с красителями. В лаборатории необходимо наличие питательных сред (сухой питательный агар, среда Кесслер, среда Эндо), агар-агара, желатина, аналиновых красителей (фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, метиленовый голубой), различные кислоты, щелочи, сода.
1. ХОД РАБОТЫ
Ознакомление с устройством микробиологической лаборатории.
Ознакомление с оборудованием микробиологической лаборатории.
Ознакомление с микробиологической посудой.
Ознакомление с основными видами микробиологических исследований.
Ознакомление с техникой безопасности в микробиологической лаборатории.
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Устройство микробиологической лаборатории
Микробиологические исследования осуществляются в специальных помещениях, называемых микробиологической лабораторией. В состав микробиологической лаборатории входят несколько помещений:
- лабораторная комната для исследований;
- комната для приготовления питательных сред;
- комната для мойки посуды (моечная);
- комната для стерилизации посуды, питательных сред (стерилизационная);
- бокс – изолированная комната для проведения работ, требующих повышенной степени стерильности. Для этого перед работой воздух и другие предметы, находящиеся в нем, обеззараживаются.
Оборудование микробиологической лаборатории
К оборудованию микробиологической лаборатории относятся приборы оптические (микроскопы, лупы), приборы термические (термостаты, автоклавы, аппараты Коха, сушильные шкафы, холодильники, микробиологические (бактериологические иглы, петли, шпатели) и хирургические инструменты (скальпели, пинцеты, держатели, ножницы), а также пробирки, чашки Петри, покровные и предметные стекла, стеклянные трубочки, капельницы с красителями. В лаборатории необходимо наличие питательных сред (сухой питательный агар, среда Кесслер, среда Эндо), агар-агара, желатина, аналиновых красителей (фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий, метиленовый голубой), различные кислоты, щелочи, сода.
Рис. 3.1. Микробиологическая посуда
а – чашка Петри; б – стекло предметное; в – стекло покровное; г – игла микробиологическая; д – петля микробиологическая;
е – шпатель Дригальского
Каждый студент должен иметь в лаборатории постоянное место работы. Рабочее место должно быть снабжено микроскопом, штативом для пробирок, бактериологическими иглами и петлями, шпателем Дригальского, пипетками, набором покровных и предметных стекол, промывалкой с водой, спиртовкой, спичками, чашкой с мостиком, набором красителей, фильтровальной бумагой, песочными часами и сосудом с дезинфицирующим раствором.
Для изучения микроорганизмов используется несколько специфических методов. Основными видами микробиологических исследований являются:
- бактериоскопическое (микроскопическое) – изучение с помощью микроскопа формы и строения микроорганизмов;
- бактериологическое – изучение культур микроорганизмов путем культивирования, т.е. выращивания на искусственных питательных средах;
- экспериментальное – определение микроорганизмов и их ядов путем заражений ими подопытных животных (мышей, белых крыс, морских свинок). Чаще всего используется для идентификации возбудителя пищевых отравлений;
- серологическое – определение микроорганизмов при помощи сыворотки крови, содержащей антитела. Этот метод широко используется в медицинской микробиологии.
При микробиологическом анализе пищевых продуктов применяются первые два вида исследований. Методом бактериологического исследования определяют культуральные признаки (размер, форму, структуру, цвет, блеск, профиль отдельной колонии) и биохимические особенности микроорганизмов (способность сбраживать вещество, входящее в состав различных питательных сред). При бактериоскопическом исследовании определяют морфологические особенности (размер, форму и т.д.) отдельных микроорганизмов и их способность окрашиваться различными красителями (тинкториальные свойства). Поскольку в природе существует много микробов-двойников, похожих по внешнему виду друг на друга, поэтому для определения вида микроорганизмов одной бактериоскопии обычно недостаточно, необходимо применение бактериологического метода исследования.
Работа в микробиологических лабораториях должна осуществляться в условиях стерильности, что является основным правилом техники безопасности. Выполнение микробиологических работ в условиях стерильности должно обеспечить предупреждение как загрязнения внешней среды и работающего персонала микробами из исследуемого материала, так и самих выделяемых чистых культур посторонними микроорганизмами из окружающей среды.
При работе в микробиологической лаборатории следует соблюдать следующие правила:
а) находиться в помещении лаборатории и работать в ней обязательно в халате;
б) пользоваться постоянным рабочим местом;
в) следить за порядком на рабочем месте, не держать на нем никаких посторонних предметов;
г) пинцеты, шпатели, микробиологические петли и иглы, пипетки после работы с микроорганизмами прожигать в пламени спиртовки или погружать в сосуд с дезинфицирующим раствором (хлорамин, дизол, карболовая кислота);
д) все использованные материалы с микроорганизмами - отработанные препараты из живых культур, временные препараты и др. - вначале обезвредить стерилизацией или дезинфекцией и только после этого мыть;
е) по окончании занятий привести в порядок рабочее место, снять халаты, и после этого обязательно вымыть руки.
1) Назначение микробиологической лаборатории, ее устройство и оснащение.
2) Как должно быть оборудовано рабочее место микробиолога?
3) Какие существуют методы микробиологических исследований и какие из них применяются для микробиологического анализа пищевых продуктов?
4) Каковы правила работы в лаборатории микробиологии?
3.2 Практическая работа № 2
«Изучение устройства микроскопа и техники микроскопирования»
Цель занятия
Познакомиться с устройством бактериологического микроскопа, сформировать умения и навыки работы с ним, использовать занятие для закрепления теоретического материала.
Оборудование
Микроскопы, предметные и покровные стекла, металлические петли (с держателем), фильтровальная бумага, кедровое масло (или использовать иммерсионное масло взамен), вода, пипетки, спиртовки, спички.
1. ХОД РАБОТЫ
1. Изучить устройство микроскопа, используя биологические микроскопы БИОЛАМ С-II (или другие) и методические указания.
2. Перечислить в тетради для практических работ основные части микроскопа, дать характеристику сухим и иммерсионным объективам, записать правило определения увеличения микроскопа.
3. Познакомиться с правилами работы с микроскопом.
4. Познакомиться со способами приготовления препаратов микроорганизмов.
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
2.1. Устройство биологического микроскопа
Для изучения микроорганизмов пользуются сложными оптическими приборами-микроскопами (от греч. micros – малый, skoreo – смотрю). Наиболее распространенными микроскопами являются БИОЛАМЫ и др. (рис. 2.1, 2.2) с предельным увеличением до 1350 раз. Микроскопы имеют две основные части: механическую и оптическую.
Механическаячасть состоит из штатива, в котором различают ножку, основание и тубусодержатель и предметного столика, прикрепляемого к основанию штатива. Предметный столик перемещается в горизонтальной плоскости с помощью двух винтов, находящихся слева и справа. На поверхности столика имеются две клеммы для закрепления препарата. Кроме того, на нем можно установить крестообразный столик, служащий для передвижения препарата в двух взаимно перпендикулярных направлениях с помощью двух винтов, расположенных справа.
Тубусодержатель поднимается и опускается с помощью макрометрического и микрометрического винтов, предназначенных для грубой и точной фокусировки объекта. Поворот винта на 1 оборот поднимает или опускает тубусодержатель на 2 мм, микрометрического – на 0,1 мм. Вверху тубусодержатель имеет гнездо для прямого или наклонного тубуса, на котором крепится револьвер, куда ввинчиваются 2-4 объектива. Замена объективов производится при повороте револьвера вокруг оси.
Рис. 3.2. Устройство и оптическая схема микроскопа МБР-1:
Оптическая часть микроскопов состоит из осветительного аппарата, объективов и окуляров. Осветительный аппарат (рис. 2.3) расположен под предметным столиком и состоит из зеркала, конденсора и ирис-диафрагмы.
Зеркало имеет две поверхности: плоскую и вогнутую, оно отражает световые лучи и направляет их к конденсору. При естественном освещении и при малых увеличениях употребляется плоское зеркало, при искусственном, как и при естественном при больших увеличениях – вогнутое.
Конденсор – представляет собой системы сильных линз для усиления яркости освещения рассматриваемого объекта. Собирая лучи света, отраженные зеркалом, конденсор концентрирует их в плоскости препарата. Передвигается конденсор в вертикальном направлении при помощи винта. При опускании конденсора поле зрения микроскопа затемняется, при поднятии – освещается.
1
2
Рис. 3.4. Осветительный аппарат:
1 – зеркало; 2 – конденсор
Ирис-диафрагма, расположенная под конденсором, состоит из тонких металлических сегментов, которые при помощи рычажка можно сдвигать или раздвигать, регулируя этим поступление света в конденсор.
Объективы являются наиболее важной частью микроскопа. Они ввинчиваются в гнезда револьвера и состоят из системы линз, заключенных в металлическую оправу. Передняя, или фронтальная, линза объектива является самой маленькой и единственной, дающей увеличение. Остальные линзы в объективе только исправляют недостатки полученного изображения и называются коррекционными.
Кроме того, объективы делятся на сухие и иммерсионные. Сухими называются объективы, при работе с которыми между фронтальной линзой и рассматриваемым предметом находится слой воздуха. Иммерсионными (от лат. immersion – погружаю) называются объективы, фронтальная линза которых при работе погружается в нанесенную на препарат каплю жидкости с показателем преломления, близким к показателю преломления стекла. Лучшим для этой цели является кедровое масло с коэффициентом преломления 1,515 (коэффициент преломления стекла 1,53). Световые лучи при переходе из стекла в слой кедрового масла не преломляются и, не отражаясь, попадают в объектив. Таким образом достигается наилучшее освещение предмета (рис. 2.4). Биологические микроскопы обычно имеют 3-4 объектива с цифровым обозначением 10 (или 8), 20, 40, 60, 90Х (иммерсионный), показывающими собственное увеличение этих объективов.
Окуляр ( от лат. оculus – глаз) вставляется в верхний конец тубуса. Окуляр представляет собой систему двух плоско-выпуклых линз, обращенных выпуклостью в сторону объектива. Линза, обращенная к глазу, называется глазной, обращенная к препарату – собирающей. Расстояние между линзами равно полусумме их фокусного расстояния. Окуляры помечаются цифрами, показывающими их собственное увеличение 5, 7, 10, 15Х.
Для того чтобы определить увеличение данной системы микроскопов, следует умножить показатель увеличения объектива на показатель увеличение окуляра. Например, при окуляре 10Х и объективе 40Х увеличение микроскопа равно 400.
Действительное изображение предмета дает объектив. Окуляр же только увеличивает изображение, данное объективом и, не прибавляя ничего нового, дает увеличенное обратное и мнимое изображение рассматриваемого объекта.
Рис. 3.5. Ход лучей при наличии между объективом и покровным стеклом воздуха, воды и иммерсионного масла:
o – предметное стекло; d – покровное стекло; p – препарат; f – передняя линза объектива; n – показатель преломления среды;
AB – оптический разрез:
а – сухой объектив; б – водная иммерсия; в – масляная иммерсия
2.2. Правила пользования микроскопом
Работая с микроскопом, необходимо соблюдать определенные правила
обращения с ним.
1. Микроскоп вынимают из футляра и переносят к рабочему месту, держа его одной рукой за ручку штатива, а другой поддерживая за ножку штатива. Наклонять микроскоп в сторону нельзя, т.к. окуляр может выпасть из тубуса.
2. Микроскоп помещают на рабочем столе на расстоянии 3-5 см от края стола ручкой к себе.
3. Сначала ставят объектив с малым увеличением (Х8) и при этом увеличении устанавливают наилучшее освещение, которое достигается при регулировке положения зеркала, конденсора и диафрагмы. При просмотре неокрашенных препаратов применяют суженную ирис-диафрагму и опущенный конденсор, при наблюдении окрашенных препаратов – открытую диафрагму и поднятый конденсор.
4. На предметный столик помещают препарат и закрепляют его клеммами.
5. Опускают объектив (Х8) при помощи макрометрического винта почти до соприкосновения с предметным стеклом на расстоянии около 0,5 см от предметного столика. Медленно вращают макровинт против часовой стрелки до появления четкого изображения препарата, после чего наводят резкость микрометрическим винтом.
6. Повернув револьвер, устанавливают объективы с большим увеличением (Х20, Х40 или Х60).
7. Во время микроскопирования нужно держать оба глаза открытыми и пользоваться ими попеременно.
8. После окончания работы, следует снять препарат с предметного столика, опустить конденсор, поставить под тубус объектив 8х, мягкой тканью протереть микроскоп и убрать его в футляр.
2.3. Методы приготовления микробиологических препаратов
Существуют два основных способа приготовления прижизненных препаратов микроорганизмов: «висячая капля» и «раздавленная капля».
Препарат «висячая капля». Небольшую каплю суспензии (взвеси) микробных клеток наносят на покровное стекло и осторожно накладывают на него предметное стекло с луночкой так, чтобы капля свободно помещалась в центре углубления. Края луночки предварительно смазывают вазелином, препарат переворачивают и микроскопируют. Этот метод применяют главным образом для изучения подвижности микробов.
Препарат «раздавленная капля» неокрашенный (нативный). На предметное стекло наносят каплю жидкости (при работе с бактериями, дрожжами – водопроводную воду, при работе с микроскопическими грибами – смесь равных объемов этилового спирта и глицерина), вносят в нее немного исследуемых микроорганизмов, размешивают и накрывают покровным стеклом. Излишек выступившей жидкости удаляют фильтровальной бумагой.
Микроскопируют препарат, как правило, сухой системой (объективы 8х, 20х, 40х). Препарат позволяет установить форму клеток преимущественно крупных микроорганизмов, их размеры, расположение, подвижность.
Препарат «раздавленная капля» прижизненно окрашенных микроорганизмов. К капле микробной суспензии на предметном стекле добавляют каплю слабого раствора (1:1000) красителя (метиленового синего или фуксина), затем размешивают и накрывают покровным стеклом. Подобным образом рекомендуется дифференцировать живые и мертвые клетки, например при исследовании пекарских дрожжей. Мертвые клетки обычно прокрашиваются быстрее и ярче вследствие посмертного повышения проницаемости клеточной оболочки.
Контрольные вопросы
1. Из каких частей состоит микроскоп?
2. Каковы правила работы с микроскопом?
3. Каково назначение макро- и микроскопического винтов? Каков порядок их использования?
4. Что такое сухие и иммерсионные объективы?
5. Зачем и как используют кедровое масло при работе с иммерсионным объективом?
6. Как устанавливается общее увеличение микроскопа?
7. Как регулировать степень освещенности препарата?
8. Почему с одной стороны зеркало плоское, а с другой вогнутое? Когда каким зеркалом пользуются?
3.3 Практическая работа № 3
«Морфология бактерий, плесневых грибов, дрожжей и техника их
микроскопирования»
Цель занятия
Ознакомиться со строением и внешним видом микроорганизмов, приобрести умения и навыки работы с микроскопом, использовать занятие для закрепления теоретического материала.
1. Рассмотреть готовые препараты бактерий при увеличении в 1350 раз (используя кедровое масло), зарисовать их и определить видовую принадлежность.
2. Приготовить прижизненные препараты плесневых грибов и дрожжей типа «раздавленная капля» (используя чистые культуры) и рассмотреть их под микроскопом при увеличении в 120 и 300 раз. Зарисовать, определить видовую принадлежность, т.е. идентифицировать и на рисунках обозначить органы размножения.
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
2.1. Микроскопирование бактерий
Для изучения формы бактерий студентам предлагаются уже готовые высушенные, фиксированные и окрашенные простым методом (фуксином Пфейффера или метиленовым синим) препараты. Для определения видовой принадлежности микроорганизмов воспользуйтесь формами бактерий, представленными на рисунке 3.6.
По форме бактерии принято делить на:
1) шаровидные (кокки), которые по расположению кокков делятся на: монококки – клетки, расположенные одиночно; диплококки – кокки, соединенные по два; тетракокки – клетки, расположенные по четыре; стрептококки – кокки, расположенные в виде длинной или короткой цепочки, сарцины – кокки, расположенные в виде пакетов, стафилококки – беспорядочное скопление кокков, чаще в виде гроздьев винограда;
2) палочковидные формы по расположению палочек подразделяют на диплобактерии – палочки, соединенные попарно, стрептобактерии – палочки, расположенные в виде цепочки;
3) извитые формы подразделяют на вибрионы, имеющие форму запятой, спириллы, имеющие несколько (до пяти) завитков и спирохеты с большим количеством мелких завитков.
Понятие «идентификация микроорганизмов» означает определение положения данного вида в систематике, т.е. его названия. Для идентификации микроскопических грибов важными признаками являются их морфологические и культуральные свойства.
К морфологическим свойствам микроскопических грибов относятся строение вегетативного тела и органов размножения. Грибы – крупные и достаточно контрастные микроорганизмы, поэтому их можно хорошо рассмотреть под микроскопом при небольших увеличениях.
Культуральными свойствами микроскопических грибов называются внешний вид грибницы (мицелия) и способ ее роста по отношению к среде обитания (поверхностный или глубокий). Мицелий некоторых грибов окрашен за счет отложения пигмента в клеточных оболочках: розовый – у гриба Фузариум, зеленый – у гриба Пенициллиум, черный – у некоторых Аспергилловых грибов. Культуральные свойства грибов исследуют невооруженным глазом (визуально).
Изучение морфологических и культуральных свойств позволяет установить название рода плесневых грибов. Обычно изучение ведется в препарате «раздавленная капля».
На его приготовление из заранее выращенных в чашках Петри на сусле-агаре чистых культур плесневых грибов Мукора, Пенициллиума, Аспергиллюса, Альтернарии, Оидиума, Фитофторы (студентам предлагаются чашки без названия плесневых грибов) или иных – отбирают часть мицелия. Материал берут двумя стерильными препаровальными иглами (стерилизуют в пламени спиртовки в процессе работы). Небольшое количество мицелия помещают в каплю смеси спирта с глицерином (5:1). Смесь используют для заполнения пространства между гифами в препарате, с тем, чтобы избежать рассеивания света и получить четкое изображение. Взятый материал необходимо иглами осторожно рассредоточить тонким слоем и наложить покровное стекло. Для изучения морфологии рекомендуется пользоваться справочными рисунками:
1. Мукоровая плесень (Mucor) – имеют мицелий, состоящий из одной сильно разветвленной клетки, от которой отходит плодоносящий гиф – спорангионосец (рис 3.7)
2. Ризопус (Rhizopus) – плесневые грибы, имеющие подобие корневых волосков. Отличаются от мукоровых тем, что от их мицелия отходят побеги - столоны, напоминающие усы клубники (рис. 3.8)
3. Аспергилловая плесень (Aspergillus) – мицелий септирован (разделен поперечными перегородками), конидиеносцы на вершине образуют расширение в виде головки, от которой отходят ответвления – стеригмы с отшнуровывающимися от них конидиями (рис. 3.9). Конидии располагаются по радиусам шара и напоминают струи воды, выливающейся из лейки.
4. Пенициллиум (Penicillini). Плесневые грибы, имеющие ветвящийся, септированный мицелий. От мицелия отходят септированныеконидиеносцы, которые на конце разветвляются в виде отростков – стеригм, напоминающих кисть руки (рис. 3.10).
а
Рис. 3.7. Mucor:
Рис. 3.8. Rhizopus:
а – споры; б – мицелий; в – спорангий; а – спорангий в разрезе; г – спорангий со спорами б – мицелийпри большом
увеличении; в – мицелий при малом увеличении
Рис. 3. 9. Aspergillus: Рис. 3.10. Penicillini
а – конидии; б – мицелий с конидиеносцами
разного возраста; в – конидиеносец (схема);
г – стеригмы
2.3. Несовершенные грибы
1. Кладоспориум (Cladosporium) (рис.3.11). Мицелий окрашен в оливково-зеленый цвет, на концах воздушных нитей расположены овальные споры в виде гроздей, окрашенных в тот же цвет. Эти грибы способны выделять темный пигмент, который окрашивает находящуюся под их колониями среду.
Рис. 3.11. Cladosporium
2. Молочная плесень(Endomyceslactis) (рис.3.12). Мицелий белый, септированный. Споры оидии отделяются непосредственно от конца мицелия в виде прямоугольных или овальных клеток, напоминающие дрожжевые. Молочная плесень в виде пушистого белого налета появляется на кисломолочных продуктах, поверхности огуречного рассола, стенах сырых помещений.
Рис. 3.12. Endomyceslactis
3. Альтернария (Alternaria) (рис. 3.13) – от мицелия отходят короткие конидиеносцы, на которых находятся многоклеточные конидии округло-грушевидной или заостренно-вытянутой формы, расположенные в одиночку или короткими цепочками.
Рис. 3.13. Alternaria Рис. 3.14. Catenularia
4. Катенулярия (Catenularia) (рис. 3.14). Образует мелкие колонии. Мицелий септирован. На воздушных гифах развиваются длинные цепочки коричневых конидий.
2.4. Микроскопирование дрожжей
Изучение морфологии дрожжей проводят при микроскопии прижизненных, как неокрашенных, так и окрашенных препаратов при средних и больших увеличениях микроскопа. При микроскопировании дрожжей необходимо обратить внимание на следующие особенности морфологии: форму и достаточно сложную структурную организацию.
Морфологические свойства дрожжей имеют возрастные особенности: в старых клетках утолщается оболочка, увеличивается зернистость протоплазмы, появляются крупные жировые включения. Поэтому исследование морфологии дрожжей является одним из способов определения технологических свойств дрожжей – их функциональной активности и жизнеспособности.
Размножение дрожжей происходит главным образом почкованием, реже спорообразованием и еще реже – простым делением (рис. 3.15., 3.16).
У спорообразующих видов дрожжей можно наблюдать под микроскопом споры различной формы: округлые, овальные идр. Обычно в клетках содержится несколько спор
Контрольные вопросы
1. На какие три группы по внешнему признаку делятся бактерии?
2. Чем отличаются (по строению) микрококки от стрептококков?
3. Каким способом размножаются бактерии?
4. Как готовится неокрашенный прижизненный препарат типа «раздавленная капля»?
5. Каковы характерные особенности плесневых грибов?
6. Почему класс дейтеромицетов называют несовершенными грибами?
7. Каковы наиболее характерные признаки размножения плесневых грибов?
8. При каких увеличениях хорошо рассматривать под микроскопом плесневые грибы и дрожжи?
9. За счет чего главным образом происходит размножение дрожжей?
10. Каковы особенности строения дрожжевых клеток?
3.4 Практическая работа № 4
«Методы культивирования микроорганизмов»
Цель занятия
Ознакомление с принципами приготовления питательных сред и методами выращивания микроорганизмов в лабораторных условиях.
Оборудование
Коллекция демонстрационных питательных сред, чашки Петри с МПА и выросшими на них микроорганизмами, пробирки, колбы, спиртовки, спички, пастеровские пипетки, бактериологические петли (с держателем), шпатели Дригальского, чашки Петри, вата, марля, ножницы.
1. ХОД РАБОТЫ
1. Ознакомление с физиологией микроорганизмов и с основной терминологией.
2. Ознакомление со свойствами и классификацией питательных сред.
3. Ознакомление с условиями выращивания микроорганизмов и методами их посева на питательные среды.
4. Самостоятельная работа: изучение культуральных свойств неизвестных бактерий, выращенных на поверхности МПА в чашках Петри.
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Физиология микроорганизмов – это раздел микробиологии, изучающий процессы жизнедеятельности микробов.
Особенности жизнедеятельности микроорганизмов, т.е. потребности в питательных веществах (тип питания), способ биологического окисления (тип дыхания), реакция клетки на воздействие различных факторов среды обитания, называются физиологическими свойствами.
Знание физиологических свойств микробов необходимо для понимания их расселения и поведения в природе, использования в народном хозяйстве и порче пищевых продуктов. Для исследования физиологических свойств микроорганизмы выращивают в лабораторных условиях.
Выращивание микроорганизмов в лабораторных условиях называется культивированием, а выращенные на питательной среде микробы – культурой.
Культуры, состоящие из различных видов микроорганизмов, называют смешанными; культуры, состоящие из одного вида микробов – чистыми.
При специальных способах посева, когда в питательную среду вносится одна клетка, в результате размножения ее образуется совокупность особей, которая называется клон. Если клон развивается на поверхности питательной среды, по мере роста числа особей он образует видимое невооруженным глазом скопление микробов, которое называется колонией.
Микроорганизмы одного вида, выделенные из определенного источника внешней среды (из организма человека, животного, пищевого продукта и т.д.), называют штаммом.
Питательные среды служат для выделения из исследуемого материала чистых культур микробов и изучения их свойств. Питательные среды являются основой бактериологических работ, нередко определяя своим качеством результаты исследований.
В состав сред, применяемых для выращивания бактерий, входят необходимые для построения белков цитоплазмы органогены: азот, углерод, водород, кислород; неорганические соединения, содержащие фосфор, калий, серу, натрий, магний, железо; микроэлементы: кобальт, йод, марганец, бор, цинк, молибден, медь и др. Все перечисленные элементы должны находиться в питательной среде в удобоусвояемом для данного микроорганизма соединении, причем требования различных микробов в этом отношении разнообразны.
Питательные вещества могут усваиваться микробами только при определенной реакции питательной среды, т.к. проницаемость оболочек микробных клеток изменяется в зависимости от рН среды. Потребность в питательных веществах и физических условиях у различных видов микробов неодинакова и этим исключается возможность создания универсальной питательной среды.
По консистенции различают плотные и жидкие питательные среды. Плотные питательные среды готовят из жидких посредством прибавления к ним клеевых веществ: агара и желатина. Агар-агар (по малайски – желе) – продукт растительного происхождения, добываемый из морских водорослей. В воде агар-агар растворяется при температуре 80-86○С, застудневает при 36-40○С. Желатин – белковое вещество животного происхождения. Применение его как уплотнителя ограничено из-за низкой (22-27○С) температуры разжижения. Плотными средами являются, например, мясо-пептонныйагар (МПА), сусло-агар (СА), мясо-пептонный желатин.
Для приготовления тщательных сред используют:
1. Продукты животного происхождения: мясо, молоко, яйца, кровь и т.д.
2. Продукты растительного происхождения: картофель и др.
3. Органические и неорганические соединения определенного состава.
Те среды, где используются натуральные продукты, называются естественными.
Синтетические питательные среды, составленные из химических соединений, называются искусственными.
Питательные среды должны:
- содержать необходимые для питания микроба питательные вещества;
- иметь реакцию рН, оптимальную для выращиваемого вида микроба;
-иметь достаточную влажность, т.к. микробы питаются по законам диффузии и осмоса;
- быть стерильными, обеспечивая тем самым возможность выращивания чистых культур микроорганизмов.
Питательные среды подразделяются на среды общего назначения и специальные. К первой группе относятся мясопептонные: агар, бульон, питательный желатин. Среды общего назначения (общеупотребительные) используют для выращивания многих патогенных микробов и применяют в качестве основы для приготовления специальных сред, добавляя к ним кровь, сахар, молоко, сыворотку и др. ингредиенты, необходимые для роста того или иного вида микроба.
К специальным питательным средам относятся элективные (избирательные) и дифференциально-диагностические питательные среды.
Элективные (избирательные) среды
Принцип их создания основан на удовлетворении основных биохимических и энергетических потребностей того вида микроба, для культивирования которого они предназначаются и менее пригодны или вовсе непригодны для развития других микробов.
Дифференциально-диагностические питательные среды используют для определения видовой принадлежности исследуемого микроба, основываясь на особенностях его обмена веществ. По своему назначению дифференциально-диагностические питательные среды разделяются на четыре основные группы:
1. для выявления протеолитической и гемолитической способности микробов, содержащие в своем составе белковые вещества: кровь, молоко, желатин, свернутую кровяную сыворотку и т.д.;
2. с индифферентными химическими веществами, которые служат источником питания для одних видов микробов и не усваиваются другими;
3. с углеводами и многоатомными спиртами для обнаружения соответствующих ферментов;
4. для определения редуцирующей способности микробов.
В настоящее время многие питательные среды изготавливают фабричным способом и выпускают в виде порошка.
Для жизнедеятельности микроорганизмов существенное значение имеют не только состав питательной среды, но и такие факторы, как кислотность среды, аэрация, температура, свет, влажность. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора, причем для различных групп микробов эти пределы часто неодинаковы.
Кислотность среды (рН) имеет решающее значение для роста многих микробов. Большинство бактерий лучше всего растет при рН, близком к 7,0; напротив, микроскопические грибы предпочитают слабокислые среды.
Аэрация
Потребности в свободном кислороде у микробов неодинаковы. Аэробы и факультативные анаэробы выращивают при доступе кислорода в обычных условиях воздушной среды. Культивирование анаэробов производится в бескислородных условиях, которые достигаются различными приемами.
Температура. Для оптимального развития микроорганизмов необходима температура, соответствующая видовым потребностям культуры. Большинство видов бактерий активно размножается при температуре 36-37○С, мицелиальные грибы – при 25-30○С, холодолюбивые микробы при температуре в пределах от 0 до 20○С. Для теплолюбивых микробов оптимальная температура роста – 45-65○С.
При отклонении от оптимальной температуры развитие микроорганизмов задерживается.
Свет
Большинство микроорганизмов не нуждаются в свете, а прямые солнечные лучи подавляют их развитие.
Техника посевов микроорганизмов в пробирки и чашки Петри с питательной средой, поэтапно показана на рис. 3.17, 3.18 и 3.19, 3.20.
в
е
д
г
б
а
Рис. 3.17. Посев микроорганизмов в пробирки со средой:
а, е – стерилизация петли; б – стерилизация краев пробирки;
в, г – взятие и посев материала; д – закрывание пробирок пробками
Рис. 3.18. Бактериологическая петля (1) и бактериологическая игла (2)
Рис. 3.19. Рассев культуры микроорганизмов на поверхность плотной среды шпателем:
1 – шпатель Дригальского; 2 – рассев; 3 – рост микроорганизмов после рассева
Рис. 3.20. Чашка Петри
Изучение культуральных свойств бактерий, выращенных на МПА в чашках Петри
В зависимости от того, где развивались клетки (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее или на дне сосуда), различают поверхностные, глубинные и донные колонии. Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются большим разнообразием и являются наиболее существенной особенностью роста микроорганизмов на плотном субстрате. При их описании учитывают следующие признаки колонии: форму (рис. 3.21), профиль (рис. 3.22), край (рис. 3.23), структуру (рис. 3.24).
Рис. 3.21. Форма колоний:
А – круглая, Б – круглая с фестончатым краем, В – круглая с валиком по краю; Г, Д – ризоидные; Е – с ризоидным краем; Ж – амебовидная;
З – нитевидная; И – складчатая; К – неправильная; Л – концентрическая,
1. Ознакомление с количественными методами исследования микрофлоры.
2. Ознакомление с понятием «средняя проба» и правилами ее забора у различных пищевых продуктов.
3. Ознакомление с устройством счетной камеры Горяева.
4. Самомстоятельная работа: приготовить дрожжевую суспензию из прессованных пекарских дрожжей; используя счетную камеру Горяева, подсчитать в суспензии количество дрожжевых клеток ( при увеличении 8Х и 20х).
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
Одним из важнейших показателей качества пищевых продуктов является содержание в них микроорганизмов.
Для определения общего количества микроорганизмов в единице объема или массы продукта исследуют так называемую среднюю пробу.
Средняя проба – это количество исследуемого материала, взятое как сумма проб из различных участков и представляющее собой среднее содержание микроорганизмов в материале.
Правила отбора средней пробы различны в зависимости от природы и консистенции исследуемого образца, а также от цели анализа.
Жидкие продукты (вода, молоко, сметана и т.п.) перемешивают стерильной ложкой (или черпаком), после чего отбирают в стерильную посуду от 50 мл до 300 мл в зависимости от вида продукта.
С продуктов полужидкой консистенции (например, мороженного) стерильной ложкой снимают верхний слой толщиной 2,5 см, размешивают продукт и отбирают для исследования 50 мл.
Пробы твердых продуктов (мясо, рыба, колбасы, кулинарные изделия), взятые из нескольких мест в толще продукта, измельчают, перемешивают и отбирают для исследования 15-20 г полученной массы. Для отбора проб с поверхности продуктов (колбасы без оболочек, некоторые готовые кулинарные изделия и др.) пользуются методами смыва и соскоба. Смыв определенной поверхности проводят стерильным увлажненным тампоном или салфеткой, ограничив площадь металлическим шаблоном (трафаретом). Соскоб производят металлическим заостренным шпателем. Снимают тонкий (около 1 мм) поверхностный слой исследуемого материала площадью 1 см2 и переносят его в стерильный физиологический раствор.
Сыпучие продукты отбирают стерильной ложкой – около 50 граммов продукта из разных мест.
Для анализа расфасованных продуктов, продуктов животного и растительного происхождения в небольшом объеме отбирают определенное количество единиц. Например, тушки птиц, расфасованные продукты – в расфасованном объеме и упаковке, хлебобулочные изделия по одному экземпляру.
Пробы берут, строго соблюдая условия стерильности (стерильная посуда и инвентарь, работа вблизи пламени). Пробу во избежание размножения микроорганизмов транспортируют в охлажденном виде и приступают к анализу не позднее чем через два часа с момента взятия пробы.
Число клеток в единице объема можно определить непосредственным подсчетом их под микроскопом либо косвенно, путем учета роста микроорганизмов на питательных средах после предварительного высева определенного объема исследуемого субстрата.
Подсчет микроорганизмов под микроскопом
Этот метод рекомендуется использовать для подсчета крупных объектов – дрожжей, грибов и некоторых относительно крупных бактерий. Обычно используют камеру Горяева (рис. 3.25). Камера Горяева представляет собой толстое предметное стекло, разделенное бороздками. На центральную часть (сверху и снизу бороздки) нанесены сетки. Площадь квадрата сетки указана на одной из сторон предметного стекла и соответствует 1/25 мм2 (большой квадрат) или 1/400 мм2 (малый квадрат). Часть предметного стекла, на которой нанесена сетка, на 0,1 мм ниже двух других сторон. Это глубина камеры; она всегда тоже указывается на предметном стекле.
Рис. 3.25. Счётная камера Горяева
При работе с камерой необходимо соблюдать определенный порядок ее заполнения. Вначале углубления с сеткой покрывают специальным шлифованным покровным стеклом и, слегка прижимая, смещают покровное стекло в противоположные стороны до появления колец Ньютона. Это указывает на то, что покровное стекло притерто к сторонам камеры. Только при таком условии объем взвеси микроорганизмов, находящийся в камере, соответствует расчётному. После этого камеру заполняют исследуемой суспензией микроорганизмов. Суспензию вносят через бороздки камеры капилляром или пипеткой. Подсчет клеток рекомендуется начинать через 3-5 минут после заполнения камеры, чтобы клетки осели и при микроскопировании были видны в одной плоскости.
Число клеток подсчитывают с объективом 8х или 40х. Обычно подсчитывают клетки микробов в 10 больших или 20 маленьких квадратах сетки, перемещая последние по диагонали. Учитывают все клетки, лежащие в квадрате сетки, а также клетки, пересекающие верхнюю и правую стороны квадрата. Количество клеток в 1мл исследуемой суспензии вычисляют по формуле
n ,
где M – число клеток в 1мл суспензии;
a – среднее число клеток в квадрате сетки;
h – глубина камеры, мм;
S – площадь квадрата сетки, мм2;
103 – коэффициент перевода мм3, см3 (мл);
n – разведение исследуемой суспензии.
Например, при подсчете взвеси дрожжей в камере Горяева обнаружено 25 дрожжевых клеток в одном малом квадрате. Густая взвесь была предварительно разведена 1: 200.
Подсчет взвеси дрожжей
.
Определение количества клеток высевом на плотные питательные среды (чашечный метод Коха)
Сущность его заключается в высеве определенного объема исследуемой суспензии микроорганизмов на плотную среду в чашки Петри и подсчете выросших после инкубации колоний. Принято считать, что каждая колония – потомство одной клетки.
Работа этим методом включает три этапа: приготовление разведений, посев на плотную среду в чашки Петри и подсчет выросших колоний.
Приготовление разведений
Численность популяции микробов обычно достаточно велика, поэтому для получения изолированных колоний необходимо приготовить ряд последовательных разведений. Разведения готовят в водопроводной воде, используя постоянный коэффициент разведения, чаще всего равный десяти. Для приготовления разведений стерильную водопроводную воду разливают по 9 мл в стерильные сухие пробирки. Затем 1 мл исследуемой суспензии стерильной пипеткой переносят в пробирку с 9 мл стерильной воды – это первое разведение, 10-1. Полученное разведение тщательно перемешивают новой стерильной пипеткой, вбирая в пипетку и выпуская из неё полученную взвесь. Эту процедуру выполняют 3-5 раз, затем этой же пипеткой отбирают 1 мл полученной суспензии и переносят во вторую пробирку – получают двадцать второе разведение, 10-2. Таким же образом готовят и последующие разведения.
Для приготовления каждого разведения следует обязательно использовать новую пипетку. Пренебрежение этим правилом приводит к получению ошибочного результата.
Проведение посева
Перед посевом поверхностным способом (рис. 3.26) разливают расплавленную, чаще всего агаризованную, питательную среду в ряд стерильных чашек Петри по 15-20 мл в каждую. Чашки оставляют на горизонтальной поверхности, пока среда не застынет. После того как среда готова, на ее поверхность стерильной пипеткой наносят точно измеренный объем (0,05 или 0,1 мл) соответствующего разведения и распределяют его стерильным шпателем по поверхности среды. Высевы на плотную среду проводят, как правило, из трех последних разведений. После посева чашки Петри помещают в термостат крышками вниз.
Рис. 3.26. Схема приготовления разведений и рассева суспензии микроорганизмов шпателем
Подсчёт выросших колоний
Колонии бактерий подсчитывают обычно через трое суток, колонии грибов и дрожжей – через 5-7 суток инкубации в термостате. Подсчет, как правило, проводят, не открывая чашек Петри. Для удобства чернилами или карандашом по стеклу отмечают просчитанную колонию точкой на наружной стороне дна чашки.
Количество клеток в 1мл исследуемого субстрата вычисляют по формуле
,
где M – количество клеток в 1мл;
a – среднее число колоний при высеве данного разведения;
10 – коэффициент разведения;
n – порядковый номер разведения, из которого сделан высев;
V – объем суспензии, взятый для посева, мл.
Контрольные вопросы
1. Назовите известные методы прямого счёта микроорганизмов?
2. Каковы преимущества и недостатки метода прямого счёта микроорганизмов?
3. Что такое счетная камера и как приводится учет микроорганизмов с ее помощью?
4. Почему при исследовании пищевых продуктов отбирается средняя проба?
5. Какие условия должны соблюдаться при заборе средней пробы?
6. Как производится забор средней пробы у твердых пищевых продуктов?
7. Какие существуют методы определения количества микроорганизмов при высеве исследуемого материала на питательные среды?
1. Ознакомление с сущностью метода определения свежести мяса бактериоскопическим методом и выписать показатели свежести мяса в соответствии с ГОСТ.
2. Приготовить и окрасить мазки из образцов мяса, и рассмотреть их под микроскопом (объектив 90х, иммерсионное масло), зарисовать их и сделать вывод о свежести мяса.
3. Ознакомление с методом оценки качества кисломолочных продуктов.
4. Приготовить и окрасить мазки из кефира или сметаны и рассмотреть их под микроскопом (объектив 90х, иммерсионное масло), зарисовать их и сделать вывод о свежести кисломолочных продуктов.
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
В соответствии с ГОСТ свежесть мяса убойных животных, субпродуктов и птицы определяют по органолептическим показателям: внешнему виду и цвету поверхности туши и мышц на разрезе, консистенции, запаху, состоянию жира, сухожилий, прозрачности и аромату бульона. Мясо сомнительной свежести хотя бы по одному из этих показателей подвергают химическому и бактериологическому анализу.
Бактериологический метод подсчета (метод отпечатков) применяется для оценки свежести мяса, однако может быть использован и для ориентировочной оценки количественного и качественного состава микрофлоры других продуктов – рыбы полуфабрикатов. Для микроскопического исследования из проб мяса готовят не меньше трех мазков-отпечатков: один из поверхностного слоя с глубины 1-2 мм, другой с глубины 2-2,5 см и третий с глубины 3-3,5 см.
Для приготовления препарата-отпечатка из поверхностного слоя мяса стерильными ножницами вырезают кусочек 0,5-1 г и срезанной стороной делают тонкие отпечатки на слегка подогретом предметном стекле. Чтобы приготовить препарат-отпечаток из глубоких слоев, поверхность мяса сначала прижигают нагретым шпателем, а затем стерильным скальпелем производят глубокий разрез, пинцетом раздвигают края, вырезают кусочек мяса и, прикладывая к поверхности предметного стекла, делают отпечатки.
Приготовленные мазки подсушивают на воздухе, фиксируют на пламени спиртовки, окрашивают по Граму и микроскопируют. Просматривают не менее пяти полей зрения. В каждом поле подсчитывают отдельно кокковые и палочкообразные микробы, а затем вычисляют их средне-арифметическое количество в одном поле зрения.
Свежесть мяса определяют по рисунку 3.27 и таблице 3.1.
Рис. 3.27. Оценка свежести мяса
Таблица 3.1
Оценка свежести мяса микроскопическим методом
Степень свежести мяса
рН
Характеристика отпечатков
Свежее
5,9-5,5
Микрофлора не обнаруживается или видны единичные экземпляры кокков, дрожжей, палочек в поле зрения препарата. Отсутствуют остатки разложившейся ткани мяса. Окраска микрофлоры грамположительная.
Сомнительной свежести
6,6
На отпечатках 20-30 кокков или несколько палочек в поле зрения микроскопа. Ясно видны следы распада мышечной ткани. Окраска микрофлоры грамположительная или грамотрицательная.
Несвежее
6,7
В поле зрения много микроорганизмов, преобладают грамотрицательные палочки (почти все поле зрения усеяно ими). Много распавшейся ткани мышц.
При микроскопическом анализе кисломолочных продуктов обязательно обращают внимание на видовой состав микрофлоры продукта. Различные кисломолочные продукты характеризуются свойственной им микрофлорой, так как для приготовления обыкновенной простокваши, кефира, сметаны и творога используются закваски, состоящие из чистых культур Str. l actis, Str. cremoris, Str. diacetilactis (рис. 3.28).
Рис. 3.28. Молочнокислые стрептококки:
а – Str. lactis, б – Str. cremoris, в – ароматобразующие
Поэтому, чтобы сделать вывод о свежести кисломолочного продукта, необходимо хорошо знать микрофлору закваски и как она выглядит под микроскопом.
Из продукта приготовляют окрашенные комбинированным фиксатором препараты (комбинированный фиксатор: смесь одной части метилового спирта, одной части эфира, 0,2 части метиленового синего). При микроскопировании определяют морфологию и количественное соотношение молочнокислых микробов закваски. Регистрируют постоянную микрофлору, которая определяет загрязненность продукта (дрожжи, бациллы, мицелий и т.п.). Для определения свежести продукта используйте справочную таблицу 3.2 .
Таблица 3.2
Микрофлора кисломолочных продуктов
Наименование продукта
Микрофлора закваски
Простокваша, ряженка
Молочнокислые стрептококки, единичные палочки
Ацидофильное молоко
Молочнокислая палочка
Кефир, кумыс
Молочнокислые стрептококки, палочки, единичные клетки дрожжей
Творог, сметана
Молочнокислые стрептококки
Контрольные вопросы
1. Как оценивают свежесть мяса бактериоскопическим методом?
2. Сколько мазков-отпечатков необходимо сделать при оценке качества мяса?
3. Какое мясо считается свежим и почему?
4. Какое мясо считается сомнительной свежести и почему?
5. Каким можно назвать мясо, если при микроскопировании в поле зрения много микроорганизмов с преобладанием палочковидных бактерий?
6. Что позволяет установить микроскопический метод определения качества кисломолочного продукта?
7. Что является анормальной микрофлорой кисломолочных продуктов?
8. Каков состав заквасок для простокваши и кефира?
9. На основании чего можно сделать вывод, что кисломолочный продукт не свежий?
3.7 Практическая работа № 7
«Санитарно-микробиологический контроль предприятия методом смывов с поверхности предметов. Санитарно-микробиологический контроль воздуха жилых помещений»
Цель занятия
Ознакомление с методом бактериологического контроля санитарного состояния действующих предприятий продовольственной торговли; изучение метода оценки санитарного состояния воздуха закрытых помещений по бактериологическим показателям.
1. Ознакомление с методом идентификации кишечной палочки E. Coli при санитарных исследованиях окружающей среды.
2. Ознакомление с микрофлорой воздушной среды закрытых помещений, ее санитарным значением и методами контроля.
3. Сделать посевы смывов с поверхности предметов, оборудования и рук для определения микробного числа и санитарно-показательных микроорганизмов.
4. Сделать забор и посев проб воздуха закрытых помещений.
2. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
На предприятиях продовольственной торговли санитарно-бактериологический контроль является обязательным разделом комплексных санитарных исследований этих предприятий и осуществляется органами санитарного надзора в плановом порядке, а также внепланово по эпидемическим показателям.
В качестве показателя санитарного состояния действующего предприятия в настоящее время широко используется характеристика микробной обсемененности поверхностей различных объектов предприятия - производственного оборудования, инвентаря, санитарной одежды, рук персонала.
Основными тестами микробной загрязненности предметов служат общее количество микроорганизмов на единице поверхности предмета (микробное число) и наличие на предметах санитарно-показательного микроорганизма – кишечной палочки как показателя фекального загрязнения объекта. В некоторых производственных помещениях дополнительно определяют наличие условно-патогенных микроорганизмов – наиболее типичных для используемого сырья (например, в мясном цехе – наличие сальмонелл, в кондитерском – наличие стафилококков).
Основным методом отбора проб для исследования твердых поверхностей является смыв с определенной площади предмета. Этот метод бактериологического исследования поверхностей называется методом смыва. Стерильными марлевыми салфетками (или тампонами), увлажненными стерильной водопроводной водой, протирают определенную площадь исследуемой поверхности, переносят салфетку в пробирку с водой, встряхивают для десорбции микрофлоры и полученную взвесь используют для анализа.
Поверхность оборудования и инвентаря исследуют на наличие кишечной палочки. Смывы с рук, санитарной одежды и полотенец берут до начала работы и после нее.
При бактериологическом исследовании смывов микробное число определяют методом Коха и выражают его на единицу поверхности предмета (обычно на 1см2).
Этапы идентификации кишечной палочки рода Escherichia:
Пересев культуры, выросшей на среде Кесслер, на дифференциально-диагностическую среду Эндо в чашках Петри.
Через сутки инкубации в термостате производят изучение посевов на среде Эндо: отбирают лактозоположительные колонии (фуксин-красные), после чего микроскопируют мазок из колонии. Проводят исследование культуры оксидазным тестом.
3. Оксидазный тест предлагается как экспресс-метод для дифференциациикишечной палочки от бактерий – сапрофитов семейства Enterobacteriaceae, которые характеризуются аналогичной морфологией-короткие грамотрицательные палочки. Но в отличие от кишечной палочки рода Escherichia они обладают ферментом – оксидазой и окисляют фенилендиаминовые соединения до индофенола ярко-синего цвета.
Материал из колоний, выросших на среде Эндо, снимают бактериологической петлей и наносят на фильтровальную бумагу, пропитанную реактивом с фенилендиаминовым соединением. В месте нанесения бактериальной массы цвет бумаги не изменяется, если оксидазный тест отрицательный, или бумага синеет в течение одной минуты, если бактерии имеют активную оксидазу.
Санитарное состояние поверхности считается отличным, если общее количество микроорганизмов на 1 см2 от 0 до 100, хорошим – от 100 до 1000, удовлетворительным – более 1000, плохим – более 10000. В исследуемых смывах не должно быть кишечных палочек, условно – патогенных и патогенных микроорганизмов. Их присутствие свидетельствует о грубом нарушении санитарных правил и необходимости проведения срочных профилактических мероприятий.
Определение микробного числа и наличия кишечной палочки в смывах требует различной обработки исследуемого материала. Поэтому каждому студенту необходимо подготовить смывы с двух аналогичных предметов.
Смыв с поверхности стола. Поверхность стола в 25 см2 ограничивают трафаретом (шаблоном), предварительно простерилизованным прокаливанием в пламени горелки. Стерильной салфеткой, смоченной 2мл стерильной воды, обтирают ограниченный трафаретом участок, опускают салфетку в пробирку, заливают 8мл стерильной воды. Аналогично приготовляют смыв с другого участка того же стола, но салфетку в пробирке заливают 5 мл среды Кесслер.
Смыв с рук. Увлажненный тампон на деревянной палочке, которым производят смыв с рук, помещают в пробирку с 2 мл стерильной воды так, чтобы он не касался поверхности воды. Перед взятием смыва с тампон увлажняют, затем тщательно протирают им ладони, межпальцевые и подногтевые пространства одной руки, помещают его в ту же пробирку, добавляют 8 мл стерильной воды. Аналогично производят смыв со второй руки, но тампон заливают 5 мл среды Кесслер.
Микробное число определяют методом Коха путем счета колоний, выросших при посеве смыва на МПА в чашках Петри.
Смывы с поверхности предметов содержат 10 мл стерильной воды (2 мл для увлажнения салфетки, 8 мл доливают к смывам), поэтому исходный смыв уже разведен 1:10.
Смывы, залитые средой Кесслер, помещают в термостат при температуре 430С на 24 часа. Затем осматривают пробирку с посевом смыва. При наличии роста производят посев материала из пробирки на поверхность среды Эндо и помещают его в термостат при температуре 37○С. Через 24 часа просматривают посевы на среде Эндо. Из лактозоположительных (красных) колоний приготавливают фиксированный мазок, окрашивают его по Граму, просматривают под микроскопом и зарисовывают. Колонии грамотрицательной палочковидной культуры исследуют на оксидазную активность.
Протокол о санитарном состоянии предметов оформляют в виде таблицы 3.3.
Таблица 3.3
Исследуемый объект
Площадь, см2
Микробное число, м.т/м3
Наличие кишечной палочки рода
Escherichia
Заключение о санитарном состоянии
Микрофлора воздуха
Воздух является одним из источников обсеменения сырья и готового продукта микробами.
Простым методом исследования микрофлоры воздуха является качественный метод оседания микробов на поверхность агара в чашках Петри. Этот метод не дает полного количественного представления о микрофлоре воздуха. Он почти не улавливает тонкодисперсные бактериальные и пылевые фракции. Однако пользуясь этим методом, можно контролировать чистоту воздуха помещений. В зависимости от предполагаемой загрязненности воздуха микробами чашки со средой экспонируют 5-10-20 минут. Чем чище воздух, тем продолжительнее экспозиция. Если поставлена цель уловить определенную группу микробов, используют элективную агаровую среду и экспозицию увеличивают на 30-50 минут.
Чтобы обнаружить микробы, содержащиеся в воздухе данного помещения, производят посев на стерильную чашку Петри со стерильным застывшим МПА. Для этого чашку Петри открывают и ставят в исследуемом помещении в таком месте, в котором нет движения воздуха. Чашку оставляют открытой на 20 минут. Затем закрывают, переворачивают вверх дном, заворачивают в бумагу и ставят в термостат на 48 часов.
По числу выросших колоний можно судить об относительном количестве микробов, содержащихся в воздухе помещения в момент посева.
Если в среднем на одной чашке спитательнымагаром выросло до 200 колоний, воздух считается чистым, свыше 200 колоний – загрязненным (табл. 3.4).
Таблица 3.4
Оценка качества воздуха жилых помещений
Воздух
Содержание микробов в 1м3
Летний режим
Зимний режим
Чистый
Загрязненный
2500
7000
По данным, полученным количественным методом, ориентировочно определено, что за 5 минут. На площадь 100 см2 осаждаются микроорганизмы, содержащиеся в 3 литра воздуха.
Контрольные вопросы
1. С какой целью проводят бактериологический контроль объектов предприятий продовольственной торговли?
2. По каким бактериологическим показателям судят о санитарном состоянии предприятий?
3. Опишите основной метод забора проб при санитарно- бактериологическом контроле поверхности предметов.
4. Какие питательные среды используют при определении микробного числа и наличия кишечной палочки методом смывов?
5. По каким бактериологическим показателям судят о санитарном состоянии воздуха помещений?
6. Опишите седиментационный метод забора проб воздуха и его санитарную оценку.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гигиенические требования к срокам годности и условиям хранения пищевых продуктов: СанПиН 2.3.2.21324-03.
2. Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека: Положение утв. Постановлением Правительства РФ 30.06.2004 № 322.
3. Общественное питание. Требования к производственному процессу: ОСТ 28-1-95.
4. СанПиН 2.3.5.021-94 Санитарные правила предприятий продовольственной торговли. УТВЕРЖДЕНЫ постановлением Госкомэпиднадзора России от 30 декабря 1994 г. N 14.
5. СанПиН 42-123-4117-86 Условия, сроки хранения особо скоропортящихся продуктов. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом СССР П.Н. Бургасовым 20 июня 1986 года.
6. СанПиН 2.3.2.1078-08 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации питания обучающихся в образовательных учреждениях».
7. СанПиН 3.5.2.1376-03 «Санитарно-эпидемиологические требования к организации и проведению дезинсекциионных мероприятий против синантропных членистоногих».
8. СП. 2.3.61079-01 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям общественного питания, изготовлению и оборотоспособности в них пищевых продуктов и продовольственного сырья».
9. СП 1.1.1058-01 «Организация и проведение производственного контроля за соблюдением санитарных правил и выполнением санитарно-противоэпидемических (профилактических) мероприятий».
10. СП 3.51.1129-02 «Санитарно-эпидемиологические требования к проведению дератизации».
11. Услуги общественного питания. Требования к персоналу: ГОСТ 30524-2013.
12. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30.03.1999 N 52-ФЗ (последняя редакция).
13. Федеральный закон «Об охране окружающей среды» от 10.01.2002 N 7-ФЗ (последняя редакция).
14. Королев, А.А. Микробиология, физиология питания, санитария и гигиена: учебник для студентов учреждений среднего профессионального образования: в 2 ч. Ч.1./А.А. Королев, Ю.В. Несвижский, Е.И. Никитенко. – 2-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2018. – 256 с.
15. Мартинчик, А.Н. Микробиология, физиология питания, санитария / А.Н. Мартинчик, А.А. Королев, Ю.В. Несвижский. – М.: Издательский центр «Академия», 2016. – 352 с.
16. Мартинчик, А.Н. Микробиология, физиология питания, санитария и гигиена: учебник для студентов учреждений среднего профессионального образования: в 2 ч. Ч.2./А.А. А.Н. Мартинчик – 2-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2018. – 240 с.
17. Матюхина, З.П. Основы физиологии питания, микробиологии, гигиены и санитарии: учебник для студентов учреждений среднего профессионального образования / З.П. Матюхина. – 10-е изд., стер. – М.: Издательский центр «Академия», 2017. – 256 с.
18. Николаева, М.А. Товарная экспертиза. М.: Деловая литература, 2015. – 288 с.
19. Рубина, Е.А. Санитария и гигиена питания / Е.А. Рубина. – М.: Издательский центр «Академия», 2017. – 272 с.
20. Трушина, Т.П. Микробиология, гигиена и санитария в торговле. – Ростов н/Д: Феникс, 2016. – 320 с.
n , 
.
, 
