Методы окрашивания микроорганизмов

Методы окрашивания микроорганизмов

Простой метод окраски. При данном методе используют только один краситель. На фиксированный препарат, помещенный на мостике над сливной чашкой, наливают раствор метиленовой сини (окрашивают 4-5 мин), либо карболовый фуксин Пфейффера (1-2 мин), либо карболовый генцианвиолет (1-2 мин). Краску смывают водой из бутыли, препарат высушивают фильтровальной бумагой и наносят каплю иммерсионного масла. Готовый препарат помещают на предметный столик и микроскопируют.

Сложные (дифференцирующие) методы окраски. Они отличаются от простых методов тем, что препарат окрашивают несколькими красками, а в отдельных случаях используют еще специальные реактивы (раствор Люголя, кислоты и др.). Сложные методы позволяют выявить наличие (или отсутствие) отдельных структурных элементов и некоторых органических соединений клетки, чем и определяют тинкториальные свойства каждого вида микроба.

Метод окраски по Граму. Фиксированный препарат окрашивают карболовым генцианвиолетом в течение 2-3 мин. Не смывая водой, краску сливают и на 2-3 мин на препарат наносят раствор Люголя (йода кристаллического — 1 г; йодистого калия как растворителя йода — 2 г; дистиллированной воды — 300 мл). Раствор Люголя сливают; препарат, не промывая водой, обрабатывают 96% -ным спиртом в течение 30 с, затем хорошо промывают водой. После этого препарат дополнительно окрашивают рабочим раствором фуксина (до 1 мин), вновь промывают водой, сушат фильтровальной бумагой и микроскопируют.

При окраске по Граму одни виды бактерий не обесцвечиваются спиртом после первичного окрашивания и сохраняют фиолетовый цвет; их называют грамположительными. Другие виды обесцвечиваются спиртом, а затем воспринимают дополнительную окраску фуксином и приобретают розово-красный цвет; их называют грамотрицательными. Окрашивание по Граму обусловлено структурными особенностями клеточной стенки у грамположительных и грамотрицательных групп микробов, длиной и формой ее пор, неодинаковым химическим составом и строением пептидогликанового слоя клеточной стенки микроорганизмов. Генцианвиолет (или кристаллвиолет) и нуклеиновые кислоты цитоплазмы в присутствии йода (раствор Люголя) образуют прочный комплекс, нерастворимый в воде и слаборастворимый в спирте. Поэтому при действии спиртом в течение 30 с бактерии с многослойным пептидогликановым каркасом (грамположительные) не обесцвечиваются. У грамотрицательных бактерий пептидогликановый слой имеет более крупные поры, что облегчает прохождение спирта; образовавшийся комплекс разрушается, клетка обесцвечивается.

Методы окраски кислото-, спирто-, щелочеустойчивых бактерий. Микробы данной группы (микобактерии туберкулеза, паратуберкулезного энтерита крупного рогатого скота, проказы человека и др.) принадлежат к грамположительным бактериям. Для их дифференциации применяют специальные методы окрашивания, основанные на различной химической структуре цитоплазмы и клеточной оболочки. В состав этих бактерий входит значительное количество жиро-восковых веществ, в частности стеариновых кислот (в том числе фтионовой кислоты до 40%), поэтому они трудно воспринимают краски. Но если они окрасились при воздействии протравителя, то трудно уже обесцвечиваются кислотами, спиртами и щелочами.

Наиболее распространенным методом окраски бактерий данной группы является метод Циля-Нильсена. На фиксированный препарат кладут кусок белой фильтровальной бумаги (для предохранения от осадка), на него наливают раствор карболового фуксина, снизу препарат подогревают над пламенем до появления паров и оставляют на «мостике» (5-7 мин). Затем краску с бумажкой сливают (не промывая) и обесцвечивают 3-5% -ным раствором серной кислоты (5-7 с), хорошо промывают водой и дополнительно окрашивают метиленовой синью Леффлера (4-5 мин). Далее препарат промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой. Кислотоустойчивые (спирто-, щелочеустойчивые) бактерии окрашиваются в красный цвет (не обесцвечиваются кислотой), а некислотоустойчивые — в синий, так как легко окрасившись фуксином, они легко обесцвечиваются кислотой и воспринимают вторичную окраску синью.

М етоды окраски непостоянных элементов микробной клетки. В структуре микробной клетки различают постоянные и непостоянные элементы. Постоянные — это цитоплазма, оболочка, ядерное вещество; непостоянные — спора, капсула, жгутики, которые при определенных условиях формируются лишь у бактерий отдельных видов, поэтому служат видовым признаком.

Окраска спор. Палочковидные микробы, образующие во внешней среде (почве, воде, кормах, на питательных средах) стойкую форму существования — спору, называют бациллами. При спорообразовании в клетке происходят процессы, обусловливающие сгущение цитоплазмы, уменьшение свободной воды (до 40%). Цитоплазматическое содержимое покрывается многослойными оболочками, химический состав которых обеспечивает высокую стойкость споры к нагреванию, высушиванию, действию многих кислот, щелочей, красителей. При законченном спорообразовании спора лежит свободно, без остатков вегетативной клетки; при незаконченном процессе спора, в зависимости от вида микроба, располагается либо в центре клетки, либо на конце (терминально), либо между концом и центром клетки (субтерминально). При микроскопировании препаратов, окрашенных простым методом или по Граму, видна окрашенная вегетативная часть клетки и неокрашенные, хорошо преломляющие свет споры.

Метод Ауески. Высушенный на воздухе препарат, не фиксируя, протравливают 0,5% -ной соляной кислотой с подогреванием (2-3 мин), охлаждают, промывают водой и фиксируют над пламенем. Затем на препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, наливают на него карболовый фуксин Циля, окрашивают с подогреванием до паров (7-8 мин), краску сливают, препарат обрабатывают 5% -ным раствором серной кислоты (5-7 с), хорошо промывают водой. Дополнительно окрашивают метиленовой синью (4-5 мин), опять промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. Микроскопируют под иммерсией: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Меллера. Фиксированный на пламени препарат протравливают 5% -ной хромовой кислотой (2-3 мин), промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой. Далее поступают, как в предыдущем методе. Результат окраски тот же: вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Златогорова. Процесс окраски, как в предыдущих двух методах, только без протравы. После окрашивания вегетативная часть клетки — синяя, споры — красные.

Метод Пешкова. Мазок фиксируют, красят метиленовой синью с подогреванием до кипения, смывают. Докрашивают 1%-ным водным раствором нейтральрота (10 с), смывают, просушивают. Споры окрашиваются в синий цвет, вегетативные клетки — в красный.

Окраска капсул. Капсула — производное наружного слоя оболочки. Представляет собой муциноподобное вещество, высокомолекулярный полисахарид. У патогенных капсулообразуюших бактерий наличие капсулы наблюдают только в инфицированном организме как защитное приспособление против фагоцитоза (на искусственных питательных средах капсулы образуются лишь при добавлении кровяной сыворотки или дефибринированной крови). Капсулообразование отмечают у возбудителей сибирской язвы, злокачественного отека, диплококковой септицемии. Капсульное вещество плохо окрашивается, поэтому для его выявления применяют специальные методы окраски, основанные на явлении метахромазии.

Метод михина. Фиксированный мазок из крови или препарат отпечаток из ткани органа (печени, селезенки, почки) окрашивают метиленовой синью с подогреванием до появления паров (5-7 мин). Краску сливают, быстро промывают водой (можно не промывать), просушивают фильтровальной бумагой. Микробная клетка окрашивается в синий цвет, капсула - в светло-розовый.

М етод Романовского-Гимза. Фиксированный препарат окрашивают, как было указано выше: мазок-препарат помещают в чашку Петри на стеклянные или деревянные палочки отпечатком вниз, под препарат подливают краску, окрашивают 40-50 мин. Результат тот же, что и при окраске по Михину: микробная клетка окрашивается в синий цвет, капсула — в светло-розовый.

Метод Ольта. Свежий водный 2% -ный раствор сафранина наливают на препарат и выдерживают 5-7 мин. Затем слегка промывают водой и высушивают. Вегетативная клетка — кирпично-красного цвета, капсула — желто-оранжевого.