Приготовление гистологических срезов. Микротомы и микротомные ножи. Техника резки на микротомах, ошибки и их устранение

Приготовление гистологических срезов. Микротомы и микротомные ножи. Техника резки на микротомах, ошибки и их устранение

Бабаджанова Туркон Мусаевна

Микротомия – это получение тонких срезов из парафинового блока, в котором заключен образец ткани. Криотомия – это получение тонких срезов из замороженного кусочка ткани при необходимости постановки срочного диагноза (срочная биопсия). Полученный срез (срезы) наносится на предметное стекло для дальнейшего окрашивания и получения гистологического препарата

► Для получения гистологических срезов используются специальные приборы – микротомы. Микротомы позволяют получить гистологические срезы различной толщины (от 3 до 5-7 микрон)

► По принципу действия различают санные, ротационные, замораживающие (криотомы), вибротомы

В рутинной гистологической практике используются санные и ротационные микротомы

Ротационный микротом Sakura SRM200

Традиционно лаборанты-гистологи работают на санных микротомах МС-2

Приготовление парафиновых срезов

► Парафиновый блок зажимают в объектодержатель

► Установив нужный угол наклона ножа (оптимальный 13-15 градусов) в зависимости от характера ткани, медленно подводят микротомный нож к блоку и приступают в резанию материала

Срезы с поверхности ножа осторожно снимаются мягкой кисточкой и расправляют

Подготовка предметных стекол

Для того, чтобы срезы прочно пристали к предметному стеклу и не отклеились во время окраски, стекла обрабатывают специальным способом с целью обезжиривания

► Предметные стекла моют в теплой мыльной воде или кипятят в 2-3 % растворе натрия гидрокарбоната (питьевой соды), затем промывают в в течение нескольких часов в проточной воде

► Обработанные таким образом стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и на несколько дней помещают в смесь Никифорова (96% этанол+ эфир, пропорция 1:1)

► Обезжиренные стекла извлекают пинцетом из смеси Никифорова, протирают чистой тканью и складывают в коробки

Для обезжиривания стекол можно использовать хромовую смесь (100 гр бихромата калия, концентрированная серная кислота и 1 литр горячей воды). Стекла выдерживают в ромовой смеси 2-3 дня, затем тщательно промывают в проточной воде в течение 1-2 дней

► Качество обезжиривания можно проверить, капнув на предметное стекло воду из пипетки: по обезжиренному стеклу вода растекается тонким слоем, а не собирается в каплю

☻ В настоящее время используются специальным образом шлифованные предметные стекла с матовой полосой для надписей, не требующие обезжиривания - стекла с адгезивным покрытием!

Приготовление белка для наклеивания срезов

► Для лучшей фиксации срезов на стекле, предметное стекло предварительно смазывают смесью яичного белка с глицерином.

► Свежий яичный белок взвивается столовой вилкой или шпателем до состояния пены

► Фильтруется в течение 24 часов через широкопористый фильтр

► К профильтрованному белку добавляется равный объем глицерина, перемешивается

► В смесь добавляется небольшой кусочек камфары или тимола для консервации

► На сухое обезжиренное предметное стекло капают маленькую каплю белково-глицериновой смеси

► Сухим чистым обработанным спиртом пальцем тщательно растирают смесь по стеклу

► Стекло проводят 2-3 раза над пламенем спиртовки (как при фиксации бактерий), намазанной стороной вверх

► Можно наклеивать парафиновые срезы

Парафиновые срезы наклеиваются на предметное стекло непосредственно с ножа

► Срезы переносят в ванночку с

теплой (35-40 С) водой, затем выла-

вливают и помещают на подготов-

ленное предметное стекло с помо-

щью изогнутой препаровальной

иглы

► Стекло со срезом подсушивают в

термостате либо на специальных

подсушивающих гистологических

столиках

Правила резания на микротомах, микротомные ножи, угол наклона и угол резания

► Микротомный нож – сложный стальной клин, у которого режущий край имеет еще дополнительную клинкообразную заточку. Длина ножа от 8 до 25 см

Различают - по длине ножа

• Малые ножи- 8-13 см, используются для замораживающих микротомов
• Средние ножи – 17-20 см, используются для рутинной резки парафиновых блоков
• Большие ножи – 25 см и более –используют для получения гистотопографических срезов в научно-исследовательских целях

По форме клина ножа

• Прямые – обе стороны ножа плоские – для парафиновых блоков (наиболее удобны и широко распространены)
• Плосковогнутые - одна сторона плоская, другая вогнутая
• Двояковогнутые – ограничены в применении, подходят только для специальных микротомов

По углу сечения лезвия ножа (по шлифу)

• Очень тонкие (ножи группы А) – острый угол заточки и тонкий шлиф – для нежных мягких тканей
• Плосковогнутые ножи группы В - для мягких тканей и рутинной работы
• Ножи группы С – для парафиновых блоков, плотных тканей

Для работы на санном микротоме используют МНОГОРАЗОВЫЕ микротомные ножи, которые периодически необходимо затачивать

В настоящее время многоразовые микротомные ножи затачивают с помощью специальных аппаратов

Однако, не потеряла актуальность ручная точка и правка микротомных ножей

Используют точильный камень, имеющий форму бруска (желтый – «бельгийский» камень и белый «арканзас»)

► Первым используют «бельгийский» желтый камень, перед заточкой на камень наносится машинное масло или керосин, глицерин, разведенный 70% спиртом. Нож проводят по камню с одного конца на другой, затем поворачивая через обушок, осуществляют движение в обратном направлении. Продолжают заточку на белом камне, имеющем более мелкозернистую поверхность

► Продолжительность заточки зависит от квалификации лаборанта и составляет в среднем от 30 минут до 1 часа, затем проводят правку ножа на ремне, натянутом на деревянную колодку

Качество заточки ножа контролируется следующим образом :

Осторожно укладывается нож на предметный столик микроскопа и перемещая его так, чтобы режущая кромка проходила через поле зрения объектива микроскопа на малом увеличении . Режущая кромка не должна иметь зазубрин и серповидной выработки и прочих дефектов режущего края

Наклон микротомного ножа и угол резания

При резке кусочков микротомный нож всегда закрепляется в зажиме микротома наклонно, под некоторым углом к горизонтальной плоскости. Нож хорошо режет при правильном наклоне. При слишком горизонтальной установке наклона ножа (тупой угол) – нож будет скользить, не захватывая срезов, при крутом наклоне (острый угол) – нож будет грубо врезаться в блок. Поэтому угол наклона ножа подбирается лаборантом опытным путем ( оптимальный угол наклона ножа 13-15 градусов ).

Угол резания – острый угол, образуемый пересечением верхней плоскости объекта (парафинового блока) с нижней плоскостью ножа. Наилучший угол резания составляет 15 градусов . Критерием правильной установки угла резания служит получение ровных срезов

На качество резки и угол наклона влияют острота заточки ножа и качество заливки парафинового блока

Недостатки работы с МНОГОРАЗОВЫМИ ножами

• Невозможно получить качественные срезы мягких тканей
• Трудности в получении тонких (до 1 мм толщиной) срезов
• Проблематичность организации процесса заточки ножа
• Дороговизна абразивных материалов, необходимых для заточки
• Необходимость закупки дополнительного оборудования для заточки ножей

В настоящее время для работы используются ОДНОРАЗОВЫЕ лезвия

Современный санный микротом sakura пр-во Япония

Микротом ротационный Accu-Cut

Угол резания

МИКРОТОМ ГОТОВ К РАБОТЕ

Причины ошибок, встречающихся при резании материала и их устранение

► парафин крошится

 Причина – тугоплавкий парафин, медленно охлаждался при заливке, низкая температура окружающей среды, большой угол наклона ножа

☻ Устранение- перед получением среза подышать на блок, изменить угол наклона ножа, перезолить объект

► Залитый материал в процессе резки выпадает из блока

 Причина – заливка проводилась холодным парафином, плохая пропитка материала, при проводке остались следы спирта

☻ Устранение- перезолить блок, предварительно поместив его в промежуточную среду для удаления спирта

► материал плохо режется или совсем не режется, ткань белесоватого цвета, срезы сморщенные, плохо расправляются

 Причина – недостаточное обезвоживание ткани

☻ Устранение- блок расплавляют в термостате и пропускают по батарее в обратном порядке до 100% спирта, затем снова заливают по схеме

► Нож как бы подскакивает, проскальзывая над поверхностью блока, не срезает ткань или на срезах образуются поперечные полосы

 Причина – переуплотнение или пересушивание материала при фиксации и обезвоживании

☻ Устранение- резать материал, поместив на него кусочек льда, если срезы не получаются, материал испорчен! Из архива вырезают новый кусочек ткани и проводят по батарее

Причины ошибок, встречающихся при резании материала и их устранение

► Срезы сморщенные, закручиваются, прилипают к поверхности ножа, мнутся

 Причина – недостаточный угол наклона ножа, высокая температура в помещении, материал залит в легкоплавкий парафин

☻ Устранение- изменить угол наклона ножа, перед резкой поместить блок в холодильник, перезолить в более твердый парафин

► Срезы покрыты полосами и легко рвутся

 Причина – плохое качество ножа (зазубрины), грязный парафин (плотные соринки), наличие в кусочке кальцинатов (каменистых включений солей кальция), встречающихся в соединительной, хрящевой костной тканях

☻ Устранение- передвинуть нож ли сменить его на хорошо заточенный, декальцинировать объект или воспользоваться микротомным ножом для резки плотных тканей

► Срез прилипает к ножу (элетризация)

 Причина – статическое электричество

☻ Устранение- перед получением среза подышать на блок

Рабочее место лаборанта-гистолога BioOptica – современные «умные» приборы для работы лаборанта - гистолога

Все необходимые рабочие модули для этапа микротомии:

- охлаждающая панель

- нагревательная панель

- ванночка для расправления срезов

- встроенная терморегулируемая водяная баня

- удобное освещение рабочего пространства

Благодарю за внимание