Просмотр содержимого документа
«Получение гибридом»
.Этапы получения гибридом, синтезирующих моноклональные антитела.
Селекция миеломных клеток.
Для получения гибридом: В-лимфоциты и миеломные клетки выделяют из мышей и крыс. Клетки миеломы (плазмоцитомы) – это злокачественные трансформированные лимфоидные клетки костного мозга, представляющие собой клоны, образованные при делении единичных измененных опухолевых В-клеток, каждая из которых синтезирует моноклональные антитела неизвестной специфичности и обладает способностью к неограниченному размножению in vivo и in vitro.
На практике чрезвычайно сложно получить миелому с заданной антигенной специфичностью, поэтому получают гибридные клетки-продуценты моноклональных антител, наследующие от миеломного партнера только способность к неограниченному размножению.
Клетки плазмоцитомы, используемые для гибридизации, получают путем мутагенеза. Они должны иметь такие селективные маркерные признаки как устойчивость к 8-азогуанину и бромдезоксиуридину – токсичным аналогам азотистых оснований, входящих в состав ДНК. Такая устойчивость обусловлена неспособностью клетки синтезировать ферменты гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазу (ГГФРТ) и тимидинкиназу (ТК), которые участвуют в процессах включения пуринов и пиримидинов в синтез нуклеиновых кислот по резервному пути биосинтеза в клетках млекопитающих. ГГФРТ участвует в синтезе пуринов, а ТК – пиримидинов при наличии соответствующих предшественников (гипоксантина и тимидина).
Выделение мутантов, неспособных к синтезу ферментов, осуществляется воздействием мутагенов на клетки миеломной линии с последующим культивированием их в среде, содержащей 8-азогуанин и бромдезоксиуридин. На среде с 8-азогуанином выживают клетки, дефектные по ГГФРТ, а на среде с бромдезоксиуридином – по ТК.
При выборе миеломной линии необходимо учитывать, что в процессе культивирования клеточные линии могут терять способность к слиянию в результате перерастания, потери устойчивости к аминоптерину или заражения микоплазмой. Поэтому успех гибридизации во многом будет определяться тем, в каком состоянии находится миеломная линия, которую выбрали для слияния.