Устройство светового микроскопа и правила работы с ним

Использование светового микроскопа в биологии и медицине

Открытие Галлилео Галлилея

Однажды Галилей соорудил очень длинную подзорную трубу. Дело происходило днем. Закончив работу, он навел трубу на окно, чтобы на свету проверить чистоту линз. Прильнув к окуляру, Галилей оторопел: все поле зрения занимала какая-то серая искрящаяся масса. Труба немного покачнулась, и ученый увидел огромную голову с выпуклыми черными глазами по бокам. У чудовища было черное, с зеленым отливом туловище, шесть коленчатых ног… Да ведь это … муха! Отняв трубу от глаза, Галилей убедился: на подоконнике действительно сидела муха.

Так появился на свет микроскоп — состоящий из двух линз прибор для увеличения изображения маленьких предметов. Свое название — «микроскопиум» — он получил от члена «Академиа деи линчеи» («академии рысьеглазых»)

И. Фабера в 1625 г. Это было научное общество, которое, кроме прочего, одобряло и поддерживало применение оптических приборов в науке.

А сам Галилей в 1624 г. вставил в микроскоп более короткофокусные (более выпуклые) линзы, благодаря чему труба стала короче.

Роберт Гук

Следующая страница в истории микроскопа связана с именем Роберта Гука. Это был очень одаренный человек и талантливый ученый. По окончании Оксфордского университета в 1657 г. Гук стал помощником Роберта Бойля. Это была отличная школа у одного из крупнейших ученых того времени. В 1663 г. Гук уже работал секретарем и демонстратором опытов Английского Королевского общества (академии наук). Когда там стало известно о микроскопе, Гуку поручили провести наблюдения на этом приборе. Имевшийся в его распоряжении микроскоп мастера Дреббеля являл собой полуметровую позолоченную трубу, расположенную строго вертикально. Работать приходилось в неудобной позе — изогнувшись дугой.

Роберт Гук

Прежде всего Гук сделал трубу — тубус — наклонной. Чтобы не зависеть от солнечных дней, которых в Англии бывает немного, он установил перед прибором масляную лампу оригинальной конструкции. Однако солнце светило все же гораздо ярче. Поэтому пришла мысль лучи света от лампы усилить, сконцентрировать. Так появилось очередное изобретение Гука — большой стеклянный шар, наполненный водой, а за ним специальная линза. Такая оптическая система в сотни раз усиливала яркость освещения.

Роберт Гук

Когда микроскоп был готов, Гук принялся за наблюдения. Их результаты он описал в своей книге «Микрография», изданной в 1665 г. За 300 лет она переиздавалась десятки раз. Помимо описаний, она содержала замечательные иллюстрации — гравюры самого Гука.

Открытие клетки Р.Гуком

Особый интерес в ней представляет наблюдение № 17 — «О схематизме, или строении пробки и о клетках и порах некоторых других пустых тел». Гук так описывает срез обыкновенной пробки: «Вся она перфорированная и пористая, подобно сотам, но поры ее неправильной формы, и в этом отношении она напоминает соты… Далее, эти поры, или клетки, неглубоки, но состоят из множества ячеек, разделенных перегородками».

В этом наблюдении бросается в глаза слово «клетка». Так Гук назвал то, что и сейчас называется клетками, например, клетки растений. В те времена люди не имели об этом ни малейшего представления. Гук первым наблюдал их и дал название, оставшееся за ними навсегда. Это было открытие громадной важности.

Антони ван Левенгук

Вскоре после Гука начал вести свои наблюдения голландец Антони ван Лсвенгук. Это была

интересная личность — он торговал тканями и зонтиками, но не получил никакого научного образования. Зато у него был пытливый ум, наблюдательность, настойчивость и добросовестность. Линзы, которые он сам шлифовал, увеличивали предмет в 200—300 раз, то есть в 60 раз лучше применявшихся тогда приборов. Все свои наблюдения он излагал в письмах, которые аккуратно посылал в Лондонское королевское общество. В одном из своих писем он сообщил об открытии мельчайших живых существ — анималькул, как Левенгук их назвал. Оказалось, что они присутствуют повсюду—в земле, растениях, теле животных. Это событие произвело революцию в науке — были открыты микроорганизмы.

Антони ван Левенгук

В 1698 г. Антони ван Левенгук встретился с российским императором Петром I и продемонстрировал ему свой микроскоп и анималькул. Император был так заинтересован всем, что он увидел и что объяснил ему голландский ученый, что закупил для России микроскопы голландских мастеров. Их можно увидеть в Кунсткамере в Петербурге.

Оптическая микроскопия

Теория получения изображения с помощью линз может быть представлена с точки зрения либо геометрической, либо физической оптики.  Геометрическая оптика  хорошо объясняет фокусирование и аберрацию, однако для понимания, почему изображение не совсем четкое и как получается контрастность, необходимо привлечь физическую оптику. В геометрической оптике существует два правила, которые следует постоянно помнить: 1) свет распространяется по прямой и 2) луч отклоняется от прямой (преломляется) на границе раздела между двумя прозрачными средами .

Идеальная линза с двумя выпуклыми сферическими поверхностями, у которых радиусы кривизны не обязательно одинаковы, имеет две фокусные точки Если две линии, изображающие лучи света, идущие из данной точки к объекту, провести таким образом, что один луч будет параллелен оси линзы, а другой пройдет через фокус , то они появятся с другой стороны линзы, причем параллельный луч пройдет через фокус, а другой луч будет параллельным оптической оси.

Объектив

Объективы микроскопов, как правило, тщательно стандартизируются по увеличению NA. Обычно NA увеличивается с уменьшением фокусного расстояния, поскольку увеличение растет с уменьшением диаметра линз

Окуляр

Окуляры Основная функция окуляра состоит в передаче изображения от объектива глазу. Существуют разнообразные системы окуляров: Рамсдена , Гюйгенса, Кельнера и компенсирующие. Три первых типа взаимозаменяемы и отличаются только способом нанесения сеток, указателей и других точек отсчета. Компенсирующий окуляр разработан для коррекции хроматической аберрации. 

Регулировка микроскопа

Для подготовки микроскопа к работе необходимо провести следующую регулировку: 1) источник света и все его компоненты должны быть отцентрированы по оптической оси прибора; 2) объектив необходимо сфокусировать и 3) требуется отрегулировать освещение. В большинстве обычных (стандартных) микроскопов конденсор, объектив и окуляр коаксиальны, поэтому центрировать требуется только источник света. Это достигается путем фокусировки на микроскопном стекле, удаления окуляра и перемещения источника света с помощью регулировочного винта до тех пор, пока свет (при наблюдении в тубус) не будет находиться в центре объектива. Если регулируется и установка по центру конденсора, то конденсор вначале вынимают, источник света центрируют, как описано выше, затем конденсор ставят на место и с помощью регулировочного винта центрируют по источнику света. Затем конденсор фокусируют на объекте для критического освещения Для того чтобы избежать влияния рассеянного и отраженного света, полевую диафрагму следует уменьшить так, чтобы освещен был только объект. Если интенсивность освещения мешает удобному наблюдению, то ее можно уменьшить. Для уменьшения интенсивности ни в коем случае нельзя изменять апертуры, для этого либо вводят перед источником света нейтральные плотные фильтры, либо уменьшают напряжение, подаваемое на источник.

Контраст

Чтобы объект был видимым, его изображение должно отличаться по интенсивности от окружающего фона. Различие в интенсивно-стях объекта и фона называется  контрастом.  К сожалению, большинство биологических образцов (клетки и их компоненты) прозрачны, т. е. их контраст близок к нулю. В прошлом для решения этой проблемы образцы окрашивали, прибавляя окрашенные вещества, которые реагировали с определенными компонентами клеток.

Изготовление микропрепаратов

Изготовление срезов препаратов Как правило, толщина кусочков материала слишком велика, чтобы сквозь них могло пройти достаточное для исследования под микроскопом количество света. Обычно приходится срезать очень тонкий слой исследуемого материала, т. е. готовить срезы. Срезы можно делать бритвой или на микротоме. Вручную срезы готовятся с помощью остро отточенной бритвы. Для работы на обычном микроскопе срезы должны быть толщиной 8—12 мкм. Ткань закрепляют между двумя кусочками сердцевины бузины. Бритву смачивают жидкостью, в которой хранилась ткань; срез делают через бузину и ткань, причем бритву держат горизонтально и двигают ее к себе медленным скользящим движением, направленным чуть вкось. Быстро сделав несколько срезов, следует выбрать из них самый тонкий, содержащий характерные участки ткани. Срез с ткани, залитой в ту или иную среду, можно сделать на микротоме. Для светового микроскопа срезы толщиной в несколько микрометров можно сделать с залитой в парафин ткани с помощью специального стального ножа. На ультратоме изготавливают чрезвычайно тонкие срезы (20—100 нм) для электронного микроскопа. В этом случае необходим алмазный или стеклянный нож. Срезы для светового микроскопа можно приготовить, не заливая материал в среду; для этого используют замораживающий микротом. В процессе приготовления замороженного среза образец сохраняется в замороженном твердом состоянии.

Простейшие под микроскопом

Многих простейших вы можете увидеть своими глазами в поле зрения под микроскопом в любое время года. Чтобы иметь для наблюдения живых простейших, необходимо заранее заготовить питательную среду, в которой они могли бы развиваться продолжительное время. Для этого в 2—3 стеклянные банки накладывают слой (толщиной 2 см) нарезанных листьев или сенной трухи, а сверху наливают (13 банки) дождевую или водопроводную воду. Банки покрывают стеклом и ставят на окно, затеняя от прямых солнечных лучей. Через 3—4 суток заливают водой, взятой из стоячего водоема (пруда, канавы), на дне которого находится гниющая растительность (трава, листья, ветки). С водой следует захватить и немного ила со дна. Через несколько дней в сосудах появится пленка, отливающая металлическим блеском. Просматривая под микроскопом капли воды, можно убедиться, какими видами простейших богата вода из банок. При таком разведении простейших сначала появляются разные виды мелких инфузорий, затем  амебы  и, наконец (через 15 суток), инфузории-туфельки.

Анализ крови

Микроскоп давно стал незаменимым помощником человека во многих сферах. В объектив прибора можно увидеть то, что не видно невооруженным глазом. Интереснейший объект для исследований представляет собой кровь. Под микроскопом можно рассмотреть основные элементы состава крови человека: плазму и форменные элементы.

Впервые состав крови человека исследовал врач - итальянец Марчелло Мальпиги. Он принял плавающие в плазме форменные элементы за жировые шарики. Клетки крови еще не раз называли то воздушными шариками, то животными, принимая их за разумных существ. Термин «кровяные клетки» или «кровяные шарики» ввел в научный обиход Антоний Левенгук. Кровь под микроскопом – это своеобразное зеркало состояния человеческого организма. 

Спасибо за внимание